肌萎縮性脊（jǐ）髓側索硬化症

因中樞神經係統內控製骨骼肌運動（dòng）的神經元退化導（dǎo）致（zhì）的肌萎縮性脊髓側索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis： ALS，也稱（chēng）漸凍人症）是一種漸（jiàn）進且致命的神經退行性疾病。由於運動神經元退化和死亡，肌肉逐漸萎縮致（zhì）大腦完全喪失控製隨意（yì）運動的能力，最終（zhōng）會造成發音、吞咽（yān），以及呼吸（xī）和運動障礙。著名物理學家霍金就是一名ALS患者。目前還沒有真正可有效治療ALS的藥物和方法。

絕（jué）大多數（90-95%）的ALS發病原因不明，但也有約5-10%的ALS患者表現出了（le）家族遺傳性，其中超氧化（huà）物歧化酶 1（Superoxide Dismutase 1：SOD1）基因突變約占（zhàn）這些遺傳性ALS病例的10%。SOD1也是第一個被鑒定出（chū）來的（de）ALS風險基因（yīn）[1]，因此很快就（jiù）有科學家構建了一種含有第93位甘氨酸突變為丙氨酸（G93A）的人SOD1基因的轉基因小鼠模型（xíng），全名為B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J轉基因小（xiǎo）鼠[2]。該轉基因小鼠基因組中被（bèi）轉入了23個拷貝的人源SOD1*G93A突變基因，接下來我們將其簡稱SOD1*G93A轉基因（yīn）小鼠。

圖二：SOD1*G93A轉（zhuǎn）基因小鼠是以B6和SJL雜交子代為背景品係，通過原核注射（shè）和（hé）胚胎移（yí）植得到的轉基因小鼠模型，因此其毛（máo）色多樣，圖片來自Jax實驗室（https://www.jax.org/strain/002726）

自1996年SOD1*G93A轉基因小鼠問世以後，其就被廣泛應用於（yú）ALS藥物研發的臨床前動物試驗中。到2004年，短短（duǎn）8年時間內，已至少有50篇文章描述了從小分子到病毒載體的各類ALS治療方案，可延長SOD1*G93A轉基因小鼠（shǔ）的壽命，其中最長可以延（yán）長壽命100天（78%的壽命（mìng）延長）。這些藥物很快進入臨床試驗，然而，迄今為止，除（chú）了利魯唑（最多延（yán）長ALS患者兩個月壽命）之外，沒有任何一種藥物顯示出對人類ALS疾病（bìng）的進程有顯著影響[3]。這給醫藥公司帶來了巨大損失，如2008年在美國國家科學院院（yuàn）刊上發表的一篇文章顯示鋰可以將SOD1*G93A轉基因小鼠的存（cún）活時間延長30天[4]。由於鋰（lǐ）早已經（jīng）被用於治療精神分裂症，許多ALS患者開始超說明書服用該藥物，希望減緩疾病進程。然而，招募了數（shù）百名患者，花費了遠超1億（yì）美元的三個同時啟動的獨立III期臨床試驗結果卻顯示鋰對ALS無任何治療效果。

其（qí）實不僅僅是ALS的藥物（wù）研發，在整個醫（yī）藥研發領域（yù），動物實驗結果（guǒ）的平（píng）均臨床轉化率也是（shì）非（fēi）常低的，平均在11%左右（yòu）  。那麽到底是什麽原因導致了如此高比例的動物實驗結果無（wú）法實現在（zài）人類（lèi）的（de）臨床轉化呢（ne）？

1999年，美國麻（má）省理工學院（yuàn）的機械（xiè）工程師詹姆斯·海伍德在得知他（tā）的（de）哥哥史蒂芬（fēn）·海伍德被確診患有（yǒu）ALS，並無（wú）任何有效治療方（fāng）法後（hòu），與家人一起創立了一家非盈利性生物技（jì）術公司，即ALS 治療（liáo）開發研究（jiū）所 (ALS-TDI)。ALS-TDI成立後（hòu）開展了一項旨在尋找SOD1*G93A轉基因小鼠實驗結果臨（lín）床轉化失敗原因的項目，即使用SOD1*G93A轉基因小鼠重（chóng）複已發表科研論（lùn）文中的動物實驗，以找出其臨床轉化失敗（bài）的原因。

在（zài）ALS-TDI開（kāi）展的重複性實驗中，他們不僅嚴格執行盲法對照，而且對給藥組和對照（zhào）組的動物進行了更為精細的分配和動物篩查以（yǐ）排除（chú）係統誤差。他們分組及實驗要求包括：

⑴ 年齡匹配；

⑵ 性（xìng）別匹配；

⑶ 同窩（wō）匹配：即（jí）使（shǐ）用同一天出生的同一非轉基因母親和轉（zhuǎn）基因父親的後代進行分（fèn）組，具體來說（shuō），治療組中的每個雄性（和雌性）在對照組中都有（yǒu）一個同（tóng）窩兄弟（和姐妹）；

⑷ 樣本量設定：每組使用動物數量為24隻（12雌，12雄）；

⑸ 死因篩（shāi）查：檢查記錄每一隻動物的死亡原因，排出非ALS致死個體；

⑹ 轉基因拷貝數監控：有研（yán）究證明SOD1*G93A轉基因小鼠在（zài）傳代過程中會出現轉基因拷貝（bèi）數丟失的現象，且低拷（kǎo）貝的轉基因小鼠的平均壽命會加長。

在這一嚴格實驗分組和動物篩（shāi）查條件下，ALS-TDI的科研人員總共使（shǐ）用了（le）5429隻SOD1*G93A轉基因小鼠測試了包括利魯唑（zuò）在內的100多種（大部分已有論文發表並證明可延長SOD1*G93A轉基因小鼠壽命）候選化合物，卻沒有發現任一化合物表現出可延長SOD1*G93A轉基因小鼠壽命的效（xiào）果（圖三）。

圖三：ALS-TDI以SOD1*G93A轉基因小鼠（shǔ）開展（zhǎn）的重複實驗結果與（yǔ）已發表實驗結果對比[3]

為找（zhǎo）出導致那些已經發表實驗結果無法被重複的原因，他們以在ALS-TDI開展實驗（yàn）中所使用的2000多隻對照小鼠作為（wéi）研究對象（xiàng），進行了計算機分組模擬實驗。由於這（zhè）些（xiē）小鼠從出生到死亡及死亡原因的（de）信息在ALS-TDI都有詳細的記錄，因此他們能夠以所有對照小鼠為（wéi）數（shù）據庫，分析前述重複實驗（yàn）中設定的不同分組和動物篩查條件（jiàn）對實驗（yàn）結（jié）果的影響。即通過計算機對這些沒有經過任何藥物處理的小鼠進行分組，將（jiāng）一組設為假定的（de）實驗組，而另一組設為假定的對照組，然後依據已有的小鼠死亡時間記錄，統計兩組小鼠之間是否存在顯著差異。經過多次重複，計算出現5%以（yǐ）上顯著差異的百（bǎi）分（fèn）比。由於這些（xiē）對照小鼠（shǔ）沒有接受過任何化合物處理，因此如果假定（dìng）的（de）實驗組和對照組中出現了顯著性差異，那麽其來源應該是分組時的係（xì）統（tǒng）誤差（chà）。

結果顯示，在樣本量大小為4的計算機分組模（mó）擬對比實驗中，在隨機分組和不進行死（sǐ）因篩查及（jí）排除低轉基因拷（kǎo）貝數個體（tǐ）條件下，兩組（zǔ）間出現顯著差異的可能性超過了50%。而隨機分組的同時進（jìn）行死因篩查並排（pái）除低轉基因拷貝數個體（tǐ）和進行（háng）性別匹配的分組條件下，樣本量為4的模擬分組實驗中也有（yǒu）30%的可能出現兩組（zǔ）死亡時間的顯著差異（圖四（sì））。隨著樣（yàng）本量的增加，出現顯著性差異的可能性逐漸減少，但要實現低於（yú）5%（統計學上通（tōng）常設置的（de）顯著置信區間）的顯著性差（chà）異，樣本量要達到每組24隻（zhī）動物。如果不做分（fèn）組（zǔ）條件控製，即使樣（yàng）本量到50隻也難以排除（chú）係統誤差。

圖四：分組條（tiáo）件導（dǎo）致的係統誤差[3]

ALS- TDI的這個計（jì）算機模擬實驗結果說明，前述那些已經發表的基於SOD1*G93A轉（zhuǎn）基因小鼠實驗結果無法實現臨床轉化（huà）的真正原（yuán）因極（jí）大可能源於其實驗（yàn）設計的不合理。這些（xiē）實驗因為沒有排除分組時的係統誤差而導致了假陽性結果（guǒ）。這個研究也暴露了當下使用實（shí）驗動物開展研究（jiū）的諸多問題，如盲目地追求減少使用動物的數量；對所用動物遺傳、微生物和繁殖等特性不了解；實驗（yàn）過程中對動物關注（zhù）不夠，不清楚動物發病或（huò）死亡的真正原因等。這些問題不（bú）僅僅需要引起實（shí）驗動物從業人（rén）員的注意，科研人員同樣需要給予關注（zhù）。因為實驗（yàn）設計不嚴謹導致的假陽性結果不僅是人力、物力和財力的巨大浪費，也嚴重（chóng）有（yǒu）違動物實驗倫理福（fú）利，這樣的實驗不會帶來科學進步，且浪費了大量實（shí）驗動物的生命。比如在ALS-TDI開展的無（wú）法重複（fù）出已發表結果的實驗中，那些已經發表（biǎo）的工作累計使用小鼠的數量就超過（guò）了（le）18000隻。此外，在（zài）動物實驗倫理申請時常用替代、優化和減少（俗稱3R原則）原則來指導倫理審查（chá）工作，有時為了滿足3R原則（zé）中的“減少”原（yuán）則，加上開展（zhǎn）實驗成本的（de）考慮，往往選擇使（shǐ）用最少的（de）動物數量（比如多為（wéi）每組6隻），但從ALS-TDI的這（zhè）個研究看，樣本量過小，會導致係統誤差加大，因（yīn）此極（jí）大可（kě）能出（chū）現假陽（yáng）性結果。這個（gè）時候大家或許忘了3R原則（zé）使用的大前提是要能夠實現擬開展實驗（yàn）的科（kē）學目（mù）標，如果單純（chún）為（wéi）了（le）“減少”而使用更少的實驗動物導致科學目標（biāo）無（wú）法實現，那（nà）不是減少，而（ér）是對動物（wù）生（shēng）命（mìng）的漠視。

參考文獻：

1.Rosen DR, Siddique T, Patterson D, Figlewicz DA, Sapp P, Hentati A, Donaldson D, Goto J, O'Regan JP, Deng HX, et al.: Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature 1993, 362:59-62.

2.Tu PH, Raju P, Robinson KA, Gurney ME, Trojanowski JQ, Lee VM: Transgenic mice carrying a human mutant superoxide dismutase transgene develop neuronal cytoskeletal pathology resembling human amyotrophic lateral sclerosis lesions. Proc Natl Acad Sci U S A 1996, 93:3155-3160.

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