
SPF小鼠是如何起源的
SPF是英文Specific Pathogen Free的首(shǒu)字母簡寫(xiě),即無特定(dìng)病原體的(de)意思,它是一個(gè)用來修飾動(dòng)物微生物(wù)質量狀態的詞匯,詳見本號(hào)前文(wén)《屏(píng)障不等於SPF》。如今,以小鼠(shǔ)為代表的SPF動物已是國際公認的標準實(shí)驗動物,在我國其生產和使用量也正在不斷地增加,2019年,我(wǒ)國實(shí)驗小鼠生產量就已超過2400萬隻。國標GB14922.1-2001《實驗動物 寄生蟲學等級及監測》和GB 14922.2-2011《實驗動物 微(wēi)生物學等級及監測》SPF小鼠排除列表中要求必須排除體表寄生蟲(chóng)、蠕蟲等5類(lèi)寄生(shēng)蟲;沙門菌和綠膿杆菌等(děng)8種細菌及以小鼠肝炎病毒和仙台病毒為代表(biǎo)的6種病毒。當下(xià),我們使用的SPF小鼠幾乎全部都是來自合格供應商提供的種源,通過屏(píng)障設施、IVC籠具等硬件設施和係(xì)統的(de)管理要求來維持種群(qún)不被外源微生物汙染,並通過定期監測這些微生物的(de)有無來確認種群微(wēi)生物狀態處於SPF級。或許我們(men)從來就沒有思考過這樣一個(gè)問題:即在SPF這一概念誕生之初,並沒有現(xiàn)成的SPF種源動物(wù)可(kě)用之時,那(nà)些最早的SPF級(jí)小鼠種群是如何建立的?
本號前文《小鼠(shǔ)病原微生物控製演化曆程》中提(tí)到“早期(1950年以前)的小鼠繁殖(zhí)種群多源自於寵物飼養場或由野外捕(bǔ)捉而來,因此攜帶多種病原體(tǐ)。”到20世紀(jì)60年代初,疾病或感染對實驗結果(guǒ)的不良影響常常讓研究人員的工作陷入困境,因此這些感染因子成了實驗(yàn)必須排除的變量。此時(shí)隨著無菌隔離器的出現及剖腹產和人工哺乳技(jì)術的建立,使培育(yù)無菌動物成為可能,並很快在小鼠、大鼠和豬等實驗動物上取得了成功(gōng)。無菌動物種群的培(péi)育和建立似乎讓(ràng)業界看(kàn)到了解(jiě)決微生物感染對動(dòng)物健康(kāng)影響和實驗結果幹擾問題的曙光,為此美國國(guó)立衛(wèi)生(shēng)研究院(yuàn) (NIH) 於1963年推出了一項新的動物飼養指(zhǐ)南,其核心內容就是使用“無菌(jun1)”實驗動物開展研究。但(dàn)後續(xù)的實踐證明無(wú)菌動物的使用和維護既耗時又費力,對(duì)於大多數實驗來說太過苛刻而無法(fǎ)推廣應用。同時還發現無菌動物同樣存在健(jiàn)康問題。如維生素K是由“正常”小鼠的腸道細菌提供的,“無菌”動物則必須在飲食中添加。在(zài)“正常(cháng)”小鼠的每克盲腸中含有1000億個細菌,而無菌動(dòng)物的盲腸因完全不含細菌而導致腫脹,部分動物盲腸變得大到在腹膜腔中發生扭曲並將小腸包裹在其周圍,形成“腸絞(jiǎo)窄”或“盲腸扭轉”。此外,超大的盲腸對(duì)動物繁殖也有影響,因為(wéi)它會與受孕的子宮(gōng)角爭奪(duó)腹腔空間,導致母鼠生產能力下降。更為關鍵的是,無菌動物隻能在無菌(jun1)環境(jìng)中生存,一旦讓它們呼吸到隔(gé)離器外(wài)的空氣,它們就會生(shēng)病甚至死亡。因為無任何其他細菌(所謂的(de)“正常”菌群)與致病菌競爭,致病菌對“無菌”小鼠的致病(bìng)性(xìng)更(gèng)強,例如(rú),在“正常”小鼠中沙門氏菌的半數致死量是一百(bǎi)萬個細菌,而在無菌小(xiǎo)鼠中僅需(xū)1-10個。另外,本來對“正常”動物(wù)不致病的機會病原體,感染後也會導致“無菌”動物死(sǐ)亡。由此看出,“無菌”不等於“無病”或健康,其也(yě)不是解決問題的答案,因此仍需尋找(zhǎo)新方(fāng)案。
無菌動物在非無菌環境下無法存活,是因為它們在成長(zhǎng)過程中因無法接觸到微生(shēng)物而導致(zhì)免疫係(xì)統(tǒng)發育不健全。那麽可否通過引(yǐn)入特定微(wēi)生物讓無菌(jun1)動(dòng)物的(de)免疫係統得以發育(yù),且(qiě)同時確保這些微生物不會導致動物生病和幹擾實驗結果呢?換句話說,就是暴露於外界環境(jìng)之前,通過引入一(yī)些即使對無菌動(dòng)物也無致病性的微生(shēng)物,進而在無菌動物體內建立特定的微生物種群,從而賦予它們有抵禦在非無菌環境下無法避免的微生物攻擊的(de)能力。如果這一特定微生物種群不包含潛在(zài)的病原體,那麽就有可能建立在非(fēi)無菌環境下(xià)存活且健康的動物種(zhǒng)群了。
二十世紀60年代中期,洛克(kè)菲勒大學的拉塞爾·沙(shā)德勒博士(shì)率先開展了這一嚐試(shì)。他從Swiss小鼠(shǔ)中分離和精選了包括大腸杆菌、糞鏈(liàn)球菌和嗜酸乳杆菌等總(zǒng)共六種細菌作為保(bǎo)護微生物(wù)種群接種給無(wú)菌小鼠,並成功解決了無菌小鼠(shǔ)在(zài)非無(wú)菌環(huán)境下生存及盲腸肥大等健康問題。這個微生物群落被稱為“沙德(dé)勒菌群(qún)”,並被提供給動物供應商(shāng)使用,以作為新衍生的(de)無菌小鼠的基礎(chǔ)微生物群(qún)。但“沙(shā)德勒菌(jun1)群”在應用時存在兼性厭氧(yǎng)菌過渡生長的情況。為此,1978年在(zài)美國(guó)國家癌症研究所資助下,沙德勒的學生羅傑·奧爾(ěr)卡特對“沙德勒菌(jun1)群”進行了改進。奧爾卡特用(yòng)從 CD-1 小鼠中分離出的微生物取代了“沙德(dé)勒菌群”中的四(sì)種原始(shǐ)細菌,並引(yǐn)入一些新的細菌最後形成(chéng)了包含八種細菌的新的菌群,被稱為“優(yōu)化沙德(dé)勒菌群”。今(jīn)天,奧(ào)爾(ěr)卡特的“優化沙德勒菌群”仍在世界各地的許多小鼠供應商的設施中使用。那麽“優化(huà)沙德勒菌群(qún)”與SPF小鼠有什麽關係呢(ne)?
為了確保無菌小(xiǎo)鼠(shǔ)在非無菌環境中生存,在將它們(men)轉移(yí)到非嚴格(gé)無菌環境(jìng)之前,故意用“優化沙(shā)德(dé)勒菌(jun1)群”汙(wū)染它們,使之形成(chéng)一種有特定微生物(wù)種群的小鼠。雖(suī)然這些接種了(le)“優化(huà)沙德勒菌群”的小鼠進入非無菌環境(jìng)後,仍然無法阻(zǔ)止其它致病和不致病的微生物的入侵,但卻可以通過嚴格的衛生管理和微生物監控阻(zǔ)止那些致病或對特定實(shí)驗有幹(gàn)擾的微生物進入,即形成(chéng)了最初的SPF小鼠。後續的研(yán)究表明(míng) “沙德勒菌群”或(huò)“優化沙德勒菌群”還可以通(tōng)過環境競爭和(hé)提前占位來阻止(zhǐ)病原體的侵入。而當下在商業公司將SPF小鼠(shǔ)銷售(shòu)到全球的每個角落(luò)時,有(yǒu)關SPF小鼠培育早期從無菌(jun1)態到含有特定微生物(wù)態(tài),再到不含特(tè)定微生物態這一曆程已經很少有人關注了。
參(cān)考文獻:
1. Laboratory Animals 2009; 43: 362–370
2. Laboratory Animal Medicine, Third Edition 1263-1296
3. ILAR Journal, 2015, Vol. 56, No. 2, 169–178